آزمایشگاه زیست سلولی

الف) مقايسه ميکروسکوپ نوري و الکتروني

اجزاي ميكروسكوپ نوري

       1- اجزاي نوري : اجزاي نوري عمدتاً مشتمل بر منبع تغذيه نور و قطعات مرتبط با آن ميباشد ، از قبيل لامپ با ولتاژ 20 وات ، فيلتر تصحيح نور و كندانسور كه كندانسور مشمل بر پنج قطعه است كه نور را تصحيح كرده و بر روي نمونه يا شيء مورد بررسي متمركز ميكند:

1 – فيلتر رنگي ( تصحيح نور )                     2 – ديافراگم كه حجم نور را تنظيم ميكند

3 – دو عدد عدسي محدب        4 – پيچ نگهدارنده كندانسور       5 - پيچ تنظيم ديافراگم

       2 – اجزاي مكانيكي :

1 – پايه ( Base ) : كليه قطعات ميكروسكوپ بر روي پايه مستقر ميباشد . در برخي از مدلهاي ميكروسكوپ نوري منبع نور ، فيوز و كابل برق در پايه تعبيه ميگردد .

2 – دسته ( Handle ) : جهت حمل و نقل ميكروسكوپ از دسته استفاده ميشود . نكته قابل توجه آنكه به هنگام جابجايي ميكروسكوپ آن را روي ميز كار نمي كشيم .

3 – لوله ميكروسكوپ  ( Barrel ): مشتمل بر عدسي شيئي ( Ocular lens ) و عدسي چشمي (Objective lens) كه با بزرگنــمائي هاي مختلف طراحي مي شوند. عــدسي شيـئي داراي بزرگنمائي هاي X4 ، X10 ،X40 ، X60 و X100 و عدسي چشمي داراي بزرگنمائي هاي X10 ، X15 ، X18 ميباشد كه بسته به نوع ميكروسكوپ متفاوت است. عدسي شيئي معمولاً از چندين عدسي محدب كه در آن تعبيه شده است تشكيل ميگردد.

4 -  صفحه گردان يا متحرك ( Revolver ) : عدسيهاي شيئي بر روي اين صفحه قرار ميگيرند و با چرخاندن آن موقعيت عدسيهاي شيئي تغيير ميكند.

5 -  پيچ حركات تند ( Macrometrique ) : اين پيچ بر روي دسته تعبيه شده است و باعث ميگردد كه صفحه پلاتين با سرعت بيشتري در جهت عمودي جابجا شود.

6 – پيچ حركات كند ( Micrometrique ) : اين پيچ بر روي پيچ حركات تند قرار داد و صفحه پلاتين را در جهت عمودي و درحد ميكرون جابجا ميكند .

7 – صفحه پلاتين ( Platine plate )  : صفحه اي است كه نمونه مورد نظر روي آن قرار ميگيرد و در جهت طول و عرض داراي دو خط كش مدرج ميباشد كه جهت ثبت و يادداشت مكان يك نمونه خاص بكار ميرود .

8 – پيچ طول و عرض : اين پيچ زير صفحه پلاتين قرار دارد كه آن را در جهت طول و عرض جابجا ميكند .

بزرگنمائي يك ميكروسكوپ حاصل ضرب بزرگنمائي عدسي شيئي در بزرگنمائي عدسي چشمي ميباشد .

2 – ميكروسكوپ ماوراء بنفش ( Ultra Violet Microscope )

ميكروسكوپ ماوراء بنفش يا ميكروسكوپ U.V.  كه منبع تغذيه نور ، اشعه U.V. ميباشد. نسبت به ميكروسكوپ نوري معمولي قدرت تفكيك بالاتري داشته چراكه اشعه ماوراء بنفش طول موج كوتاهتري نسبت به نور مرئي دارد . عدسي شيئي بكار رفته در اين ميكروسكوپ از جنس كوارتز ميباشد. بدليل مضر بودن اشعه ماوراء بنفش براي چشم انسان، از تصوير شيء عكسبرداري شده و سپس بر روي صفحه مانيتور قابل مشاهده است ( قدرت تفكيك 600 آنگستروم ).

ميكروسكوپ الكتروني ( Electron Microscope )

قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی از میکروسکوپ نوری بهتر است به این معنی که با میکروسکوپ الکترونی اجزای کوچکتری را می توان دید. قبلا گفته شد حد تفکیک (R) به طول موج نوری بستگی دارد که به نمونه می تابد. در حقیقت بین این دو رابطه مستقیمی وجود دارد یعنی هر چقدر طول موج تابشی کوچکتر باشد ،R نیز کوچکتر و قدرت جداسازی بیشتر است. در میکروسکوپ الکترونی بجای استفاده از نور مرئی از امواج الکترون ها استفاده می شود. در شرایط مناسب طول موج الکترون ها به nm ۰/۰۰۵ می رسد. در این طول موج بهترین R ممکن حدود nm ۰/۰۰۲ است. در عمل به علت محدودیت های دیگر ، قدرت جداسازی میکروسکوپ های الکترونی هیچ وقت به این خوبی نیست.حد تفکیک با میکروسکوپ الکترونی برای ملکول های تخلیص شده ی زیستی ، حدود ۰/۱ نانومتر و برای سلول ها ۲ نانومتر است که دست کم 100 برابر بهتر از بهترین میکروسکوپ های نوری است.

دو نوع میکروسکوپ الکترونی به نام میکروسکوپ الکترونی گذاره و میکروسکوپ الکترونی نگاره وجود دارد. میکروسکوپ الکترونی گذاره (transmission electron microscope) زودتر اختراع شد و قدرت جداسازی بهتری دارد. در این نوع میکروسکوپ ، الکترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می کنند و از مناطقی دیگر بازتابیده می شوند. عامل تعیین کننده در این امر در نهایت ویژگی اتم های تشکیل دهنده ی مناطق مختلف سلول است. الکترون های عبوری در دستگاه تشخیص داده می شوند و تصویری از نمونه حاصل می شود. سلول های زنده با میکروسکوپ الکترونی قابل مشاهده نیست.

يكي از تجهيزات بزرگ علمي ميكروسكوپ الكتروني است كه براساس قوانين نوري كار ميكند دراين دستگاه شار الكترون پر انرژي از يك منبع الكترون خارج شده وتحت شتاب به طرف هدف ميرود در مسير خود از روزنه هاي تعبيه شده در يك فلز عبور كرده وبا عبور از لنزهاي مغناطيسي بر روي شي مورد نظر تابانده شده ودر نتيجه بازتاب نور تصوير شي ديده خواهد شد.

اطلاعاتي را كه ميكروسكوپ الكتروني ارائه ميدهد:

1 - توپوگرافي شئ : (نقشه برداري )كه با اشكار كردن مشخصات سطح و بافت داخلي شئ ميتوان به خواصي مانند سفتي و ميزان ار تجائي بودن ان پي برد.

2 - مورفولوژي (ريخت شناسي): از ان رو كه در اين رويت شكل و سايز ذرات مشخص است ميتوان به سختي و استحكام پي برد.

3 - تركيب: اين ميكروسكوپ ميتواند عناصر سازنده شئ را مشخص نمايد بنابراين ميتوان به خواصي مانند نقطه ذوب اكتيويته شئ نيز دست يافت.

4 - بلورشنا سي: ميكرو سكوپ الكتروني چگونگي چيده شدن اتمها را در مجاورت يكديگر را مي دهد وبه اين تر تيب ميتوان انها را از نظر رسانايي و خواص الكتريكي بررسي نمود.

منبع : khayam.persianblog.com

پيشرفته ترين ميكروسكوپ قرن حاضر، با قدرت تفكيك 2 آنگستروم است. در اين ميكروسكوپ با عبور پرتوهاي الكتروني ساطع شده از رشته سيمي تنگستن با طول موج بسيار پائين از عدسي هاي متعدد كه در نهايت بر روي يك صفحه فلورسنت يا صفحه مانيتور، عكسبرداري صورت گرفته و تصوير شيء قابل مشاهده ميباشد.

قدرت جداسازی ميكروسكوبهای الكترونی از ميكروسكوپ نوری بهتر است به اين معنی كه با ميكروسكوپهای الكترونی اجزای كوچكتر را می توان ديد. قبلاً متذكر شديم كه بين R و طول موج نور تابيده شده به نمونه رابطه مستقيمی برقرار است، يعنی هر چقدر طول موج تابشی كوچكتر باشد، R نيز كوچكتر و قدرت جداسازی بيشتر است. طول موج نور مرئی بين mm300 تا 800mm و بهترين حد تفكيك ميكروسكوپهای نوری 200nm است.

در ميكروسكوپهای الكترونی به جای استفاده از امواج نور مرئی، از امواج الكترونها استفاده می شود. در شرايط مناسب، طول موج الكترونها به ۰.۰۰۵ نانومتر  می رسد، يعنی حدود 000/100 برابر كوتاهتر از طول موج نور مرئی. در اين طول موج، بهترين R ممكن حدود ۰.۰۰۲ نانومتر است. در عمل، به علت محدوديتهای ديگر، قدرت جداسازی ميكروسكوپهای الكترونی هيچ وقت به اين خوبی نيست. حد تفكيك (R) با ميكروسكوپ الكترونی برای مولكولهای تخليص شده زيستی، حدود nm0.1 و برای سلول ها حدود 2nm است كه دست كم صد برابر بهتر از ميكروسكوپ های نور است.

دو نوع ميكروسكوپ الكترونی بنام های ميكروسكوپ الكترونی گذاره و ميكروسكوپ الكترونی نگاره وجود دارد.

ميكروسكوپ الكترونی گذاره:

اين ميكروسكوپ زودتر اختراع شده و قدرت جداسازی بهتری دارد. در اين نوع ميكروسكوپ، الكترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می كنند و از مناطقی ديگر بازتابيده می شوند. الكترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می كنند و از مناطقی ديگر بازتابيده می شوند. الكترون های عبوری در دستگاه تشخيص داده می شوند و تصويری از نمونه حاصل می شود. جزئيات روش های تثبيت، برش گيری و رنگ آميزی برای ميكروسكوپ الكترونی اختصاصي است. به عنوان مثال، برای رنگ آميزی نمونه از فلزات سنگين مانند طلا استفاده می شود تا الكترون ها از اندامك ها و ساختارهای درون سلولی، مثل ريبوزوم، و مولكول های بزرگ سلول مثل DNA، با ميكروسكوپ الكترونی گذاره قابل تشخيص هستند، اما جايگاه اتم های تشخيص دهنده مولكول ها معمولاً تعيين نمی شود.

 ميكروسكوپ الكترونی نگاره:

میکروسکوپ الکترونی نگاره (scanning electron microscope) نوع ساده تر میکروسکوپ الکترونی است برای بررسی نمونه با این میکروسکوپ ، نمونه با لایه ای نازک از فلز سنگین به صورت یکنواخت پوشیده شود. الکترون های تابیده شده به سطح نمونه از هیچ ناحیه ای از آن عبور نمی کنند، بلکه در برخورد با سطح نمونه باعث تولید الکترون های بازتابیده می شوند. این الکترون ها تشخیص داده شده و تصویری سه بعدی از سطح نمونه حاصل می گردد. قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی نگاره حدود nm10 است.

اين نوع ساده ترين ميكروسكوپ الكترونی است. برای بررسی نمونه با اين نوع ميكروسكوپ، نمونه با لايه ای نازك از فلز سنگين به صورت يكنواخت پوشيده می شود. الكترونهای تابيده شده به سطح نمونه از هيچ ناحيه ای از آن عبور نمی كنند، بلكه در برخورد با سطح نمونه باعث توليد الكترون های بازتابيده می شوند، اين الكترونها تشخيص داده می شوند و تصويری سه بعدی از سطح نمونه حاصل می گردد. حد تفكيك ميكروسكوپ الكترونی نگاره حدود 10nm است.

 ميکروسکوپ هاي جديد

ميكروسكوپ STM :( Microscope  Scanning Tunnelig)

میکروسکوپ STM و میکروسکوپ پرتو X

STM حروف اول Scanning Tunneling Microscope است این نوع میکروسکوپ در دهه 1970 اختراع شد و مخترعان آن در سال 1981 جایزه نوبل را دریافت کردند.همانطور که گفته شد طول موج محدودیتی برای میزان R تعیین می کند. نوآوری STM در این است که در آن امواج نوری یا امواج نوع دیگر به کار گرفته نمی شودو هیچ نوع عدسی در آن وجود ندارد.بیان دقیق نحوه کار این میکروسکوپ خارج از توان این مطلب است ولی به طور خلاصه سوندی که نوک آن به اندازه یک اتم است، ویژگی های نمونه را در ابعاد اتمی روبش می کند. STM ساختار سطحی نمونه را بررسی می کند.اما میکروسکوپ مشابه دیگر ویژگی های الکتریکی ، مغناطیسی و یا دمای نمونه را تعیین می کنند. در حال حاضر این میکروسکوپ ها برای نمونه های زیستی و بیشتر برای نمونه های غیر زیستی مورد استفاده قرار می گیرند.

میکروسکوپ پرتو X نوع دیگری از میکروسکوپ های نوین است که کاربرد بیشتری برای نمونه های زیستی دارد. قدرت جداسازی آن چند صد آنگستروم و ضعیف تر از میکروسکوپ الکترونی است ، اما سلول های زنده با آن قابل بررسی هستند

STM حروف اول Microscope  Scanning Tunnelig  است. اين نوع ميكروسكوپ در دهه 1970 اختراع شد و مخترعان آن در سال 1981 جايزه نوبل را دريافت كردند. همان طور كه گفته شد طول موج، محدوديتی برای ميزان R تعيين می كند. نوآوری STM در اين است كه در آن امواج نوری يا امواج نوع ديگری بكار گرفته نمی شوند و هيچ نوع عدسی در آن وجود ندارد. بطور خلاصه سوندی كه نوك آن به اندازه يك اتم است، ويژگی های نمونه را در ابعاد اتمی روبش می كند. STM ساختار سطحی نمونه را بررسی می كند اما میكروسكوپ های مشابه ديگر ويژگی های الكتريكی، مغناطيسی و يا دمای نمونه را تعيين می كنند. در حال حاضر اين ميكروسكوپ ها برای نمونه ای زيستی و بيشتر برای نمونه های غير زيستی مورد استفاده قرار می گيرند.

میکروسکوپ های پلاریزان

در بسیاری از مطالعات میکروسکوپی مثل مطالعه سنگها ، مواد شیمیایی کریستالی و بسیاری از ترکیبات آلی مثل ساختمان کراتین ، عضلات ، کلاژنها نیاز به استفاده از میکروسکوپهای پلاریزان می‌باشد. جز اینها در مطالعات میکروسکوپی پلاریزان نور پلاریزه می‌باشد.

نور پلاریزه

نور معمولی متشکل از فوتونها هستند دارای بردارهای الکتریکی و مغناطیسی عمود بر هم می‌باشند. این دو میدان بطور سینوسی در حال نوسان می‌باشند و در ضمن در جهت عمود بر صفحه دو میدان و یا صفحه ارتعاشات این دو منتشر می‌شوند. ارتعاشات میدان الکتریکی نور غیر پلاریزه در یک نقطه در همه جهات می‌باشد. اکثر مواد شیشه‌ای و بسیاری از مواد دارای این ویژگی هستند که وقتی یک دسته پرتو نوری به آنها وارد شود در آن صورت سرعت انتشار و نحوه انتشار نور در جهات مختلف در آنها مشابه و یکسان می‌باشد و تنها تغییری که در نحوه حرکت دسته پرتو ضمن عبور از این مواد حاصل می‌شود آن است که بر اساس قوانین اسنل مسیر و جهت آنها نسبت به قبل از ورودشان به آن ماده تغییر می‌کند. اینگونه مواد را مواد ایزوتروپیک (isotropic) می‌نامند. مواد ایزوتروپیک در همه جهات دارای ضزیب شکست مشابه هستند.

بعضی مواد شفاف و نیمه شفاف دارای دو ضریب شکست می‌باشند، یعنی نحوه انتشار نور در داخل این مواد در جهات مختلف متفاوت است. وقتی که یک دسته پرتو نوری به داخل این گونه مواد وارد می‌شود اگر نور غیر پلاریزه باشد در آنصورت به دو دسته پرتو تقسیم می‌شود. این دو دسته پرتو در جهات عمود بر هم حرکت می‌کنند و ارتعاشات میدان الکتریکی آْنها کاملا بر هم عمود می‌باشد. هر دسته پرتو بنام نور پلاریزه شده و صفحه ارتعاش آنها را صفحه پلاریزاسیون می‌نامند. موادی که دارای این چنین خاصیتی هستند بنام مواد غیر ایزوتوپ می‌نامند. بعضی مواقع نیز اینگونه مواد را مواد با ضریب شکست دو گانه می‌نامند. در بررسیهای پلاریزاسیون لازم است که ما نور پلاریزه داشته باشیم این عمل را بوسیله یک صفحه پلاریزور می‌توان انجام داد. نور خارج شده از صفحه پلاریزور یک نور پلاریز است. میدان الکتریکی این فوتونها تنها در امتداد محور پلاریزاسیون صفحه پلاریزور ارتعاش می‌نماید.

روشهای تولید نور پلاریزه

نور پلاریزه را می توان به طرق مختلف ایجاد نمود. روشهاتی معمول عبارتند از:

بازتابش

شکست مضاعف

جذب انتخابی

پراکندگی

در اینجا دو روش ایجاد نور پلاریزه مورد نیاز در میکروسکوپهای پلاریزان را مختصرا توضیح می‌دهیم:

منشور نیکول

این منشور از بلور کلسیت درست شده است (کلسیت یا کربنات کلسیم). نور هنگام عبور از بلور کلسیت به دو دسته پرتو تجزیه می‌شود به گونه‌ای که اگر این بلور را مثلا بر روی نوشته‌ای قرار دهیم نوشته‌ها بصورت مضاعف دیده می‌شود. نور وارد شده به کلسیت به دو دسته پرتو تجزیه می‌شود، که یکی تابع قوانین اسنل است که آنرا شعاع عادی می‌نامند. دسته پرتو دیگر از قوانین نور عادی پیروی نمی‌کند لذا به آن پرتو غیر عادی گویند. مسیر نور عادی و نور غیر عادی و همچنین سرعت انتشار این دو دسته پرتو با همدیگر متفاوت است، البته هر دو دسته پرتو نور پلاریزه می‌باشند.

منشور نیکول (Nicol) بدین گونه ساخته می‌شود که یک بلور کلسیت را در امتداد قطرش برش می‌دهند سپس قطعات بدست آمده را بوسیله صمغ مخصوصی بنام صمغ کانادا (Canada blasm) به همدیگر می‌چسبانند. ضریب شکست این ماده 55/1 است که از ضریب شکست کلسیت برای شعاع عادی 656/1n= کمتر است و از ضریب شکست شعاع غیر عادی 482/1=n بیشتر می‌باشد. لذا وقتی که نور به محل اتصال دو نیمه می‌رسد نور غیر عادی انعکاس کلی پیدا می‌کند و تنها نور عادی از آن خارج می‌شود و بنابراین نور خارج شده یک دسته پرتو پلاریزه شده می‌باشد. می‌توان پلاریزه بودن نور خارج شده را بوسیله یک منشور دوم امتحان نمود. در صورتی که دو منشور نیکل به موازات همدیگر قرار گیرند نور خارج شده از اولی بدون تغییر از دومی نیز خارج می‌شود و در صورتی که محور پلاریزاسیون آنها عمود بر هم قرار گیرند نور پلاریزه خارج شده از اولی از دومی عبور نمی‌نماید.

تورمالین

نوع دیگری از پلاریزورها که بر اساس جذب انتخابی عمل می‌کنند موادی مثل تورمالین می‌باشند. اینگونه مواد وقتی نور غیرپلاریزه به آنها بتاید پس از ورود مثل بلور کلسیت در آن شکست مضاعف اتفاق می‌افتد و لیکن شعاع عادی آن در صورت ضخامت کافی بلور کاملا در داخل بلور جذب می‌شود و شعاع غیر عادی از بلور خارج می‌شود. بنابراین بلور تورمالین ارتعاشات را در یک راستا جذب و ارتعاشات در جهت عمود بر آن را عبور می‌دهد. این خاصیت تورمالین مربوط به ساختمان ملکولی آن می‌باشد. ماده تورمالین را نمی‌توان به جای منشور نیکول استفاده نمود، بخاطر آنکه این بلور رنگین است لذا نور سفید از آن عبور نمی‌کند.

آنالیزور (Analyser)

آنالیزور یک پلاریزور دیگر است که نحوه کار آن دقیقا مشابه پلاریزر است بجز آنکه محل نصب آن در پشت پلاریزور واقع می‌باشد. آنالیزور در میکروسکوپهای پلاریزان بین عدسی شیئی و چشم مشاهده کننده واقع است. موقعی که در میکروسکوپها از منشور نیکول استفاده می‌شود. معمولا آنرا درست بالای عدسی شیئی و یا درست بالای عدسی چشمی قرار می‌دهند تا از ایجاد مانع در مقابل نور جلوگیری نماید و لیکن در میکروسکوپهایی که از فیلترهای پلاروئید به عنوان آنالیزور استفاده می‌شود این ----- در داخل لوله عدسی نصب می‌گردد و دارای ورنیه می‌باشد که درصد چرخش آنرا می‌توان مشخص نمود.

عمدتا وقتی که نمونه‌ها را بوسیله نور پلاریزه مورد تابش قرار دهیم و مشاهده نمائیم تصویر مشابه حالتی است که از نور غیر پلاریزه استفاده می‌شود. اما وقتی که در مقابل آن یک آنالیزور قرار دهیم در آنصورت مشاهده می‌شود که با چرخش آنالیزور در جهات مختلف روشنایی تصویر متفاوت خواهد بود. در حالتی که محور پلاریزاسیون پلاریزور و آنالیزور بر همدیگر عمود باشند، در آن صورت نوری از آن به چشم مشاهده گر نمی‌رسد و در صورتی که دو محور به موازات هم باشند حداکثر نور خارج می‌شود. در این صورت می‌توان تأثیر نمونه در چرخش نور را مشاهده و اندازه گیری نمود. در حالتی که محور پلاریزاسیون پلاریزور و آنالیزور بر همدیگر عمود باشند کلیه نورهایی که مستیقما از پلاریزور به آنالیزور می‌رسند متوقف می‌شوند و از آن خارج نمی‌شوند و تنها آن بخش از نورهایی که بوسیله نمونه خارج و تغییر جهت داده می‌شود بوسیله آنالیزور عبور داده می‌شود و می‌توان بنابراین تأثیر نمونه را بر روی نور پلاریزه عبوری مطالعه نمود.

عدسیهای مختلفی که در ساختمان میکروسکوپهای پلاریزان مورد استفاده قرار می‌گیرد بایستی بدون هیچگونه رگه باشد و علاوه بر آن نبایستی خود دارای اثر پلاریزه کنندگی باشند. در صورتی که از میکروسکوپهای معمولی بخواهیم برای بررسی خواص کندانسور استفاده نماییم باید آن را آزمایش نمود که این اشکالات در آنها وجود نداشته باشد. وجود زاویه در هر یک از عدسیها خود می‌تواند موجب اثر پلاریزه کنندگی نور شود و بنابراین برای مطالعه نمونه‌هایی که خاصیت پلاریزه کنندگی آنها کم است بهتر است روزنه نور را تا حد ممکن کم نمود تا تأثیر زاویه دار بودن کمتر شود.

وسایل ملحقات یک میکروسکوپ پلاریزان

با اضافه کردن وسایل لازمه به یک میکروسکوپ به گونه‌ای که بتوان در آن از نور پلاریزه استفاده نمود اطلاعات مفیدی از نمونه‌ها می‌توان بدست آورد. در حالت بسیار ساده می‌توان با افزودن یک صفحه ساده پلاریزور و یک صفحه آنالیزر که بشود آنها را چرخاند می‌تواند این کار انجام شود. لیکن در اندازه گیریهای دقیق و مواقعی که اندازه گیری مقداری مورد نیاز باشد بایستی از میکروسکوپ پلاریزان استفاده شود. تجهیزات اضافی یک میکروسکوپ پلاریزان را می‌توان بطور مختصر بصورت زیر برشمرد:

پلاریزور و آنالیزور که بتوانند به داخل و یا خارج محلهای مربوطه منتقل شوند و همچنین حول محور قائم بچرخند و در ضمن جهت آنها نیز نسبت به همدیگر قابل تعیین باشد.

خطوط متقاطع که بر روی چشمی نصب شوند بگونه‌ای که بتواند پس از نصب و تنظیم ثابت شوند و از چرخش آن جلوگیری نماید. خارهایی که بتوان خطوط را بطور ثابت بطرف شمال – جنوب ، شرق – غرب یا در زاویه 45 درجه نسبت به این جهتها قرار دهد.

پایه نگه دارنده نمونه (machanical stage) که بتوان آنرا به تدریج بوسیله یک ورنیه چرخاند.

وسیله مناسب برای چرخاندن و یا انتقال پایه (stage) و هم محور کردن با محور اپتیکی.

شیارهایی در بدنه جهت وارد کردن جبران کننده. جبران کننده‌ها در زیر پلاریزر در شکاف مخصوص خود قرار می‌گیرند. این وسایل جهت جبران تأخیر فاز نمونه‌های بلورین ناشناخته بکار می‌روند.

یکم مرحله کندانسور در بالای پلاریزور

یک عدسی برتراند و دیافراگم برزای امتحان و بررسی نوارهای تداخلی.

میکروسکوپ تداخلی

میکروسکوپهای تداخلی بوسیله کمپانی‌های متعددی ساخته می‌شوند. این میکروسکوپها دارای ساختارهای متعدد و متفاوتی می‌باشند، اساس کار این میکروسکوپها بر مبنای تداخل نور عبور نموده از نمونه‌های شفاف که دارای فازهای متفاوت هستند و یا تداخل نور منعکس شده از نمونه‌های کدر یا پرتوهای نور دیگری که با این نورها دارای اختلاف راه هستند عمل می‌نماید و بدین طریق ساختار داخلی نمونه و یا سطح آن قابل مشاهده می‌شوند. در صورتی که از طریق تداخل نورهای عبور نموده از نمونه تصویر بدست آید، روش عمل کنتراست تداخلی دیفرانسیلی (DIC) و در صورتی که تصویر از انعکاس سطح نمونه حاصل شود آنرا میکروسکوپ تداخلی انعکاسی می‌نامند.

میکروسکوپ تداخلی DIC

در یک سیستم DIC نور عبور نموده از هر قسمت نمونه مواجه با بخشی از نمونه است که با قسمتهای مجاور دارای اختلاف فاز می‌باشد. علت این تفاوت فاز مربوط به ضریب شکست متفاوت نمونه می‌باشد. در اثر تداخل حاصله بین نورهای خارج شده از نواحی مختلف قابل مشاهده می‌شوند. نور حاصله از چشمه به دو بخش تقسیم می‌شود. دسته پرتو R بنام مرجع (Reference beam) شناخته شده است با دسته پرتو O که از نمونه مورد آزمایش عبور نموده است تداخل نموده و بخاطر آنکه دو دسته پرتو O,R دو دسته پرتو همدوس می‌باشند، لذا نوارهای تداخلی قابل تشخیص تشکیل می‌گردد. روش تصویر با استفاده از دسته پرتوهای مختلف و ایجاد تداخل برای مدت زمان بسیار طولانی مورد استفاده قرار گرفته است. یکی از طرقی که بسیار مورد استفاده قرار گرفته است، روش مربوط به جامین (Jamin) می‌باشد. در این روش با توجه به روش پلاریزاسیون دو دسته پرتو را از یک دسته پرتو ایجاد نموده و سپس آن دو را با همدیگر ترکیب می‌نماید.

تداخل سنج جامین (Jamin’s interferometer)

نور از چشمه S توسط صفحه پلاریزور S به نور پلاریزه تبدیل می‌شود و سپس بوسیله صفحه کلسیت C به دو دسته پرتو عادی و غیر هعادی تبدیل می‌شود. پس از آن نور از یک صفحه نیم موج عبور نموده و نتیجتا نور O به طور غیر عادی و نور E نور عادی تبدیل می‌شوند. پس از آن این دو پرتو از صفحه کلسیت دوم عبور نموده ، این صفحه مشابه صفحه اول می‌باشد. در اثر پدیده فاز موج تغییر نموده و در نتیجه تداخل این دو موج تولید نوارهای تداخلی می‌شود که قابل دیدن است.

میکروسکوپ تداخلی اسمیت- بیکر

اسمیت و بیکر در واقع جز اولین کسانی بودند که با کاربرد سیستمهای تداخلی ، میکروسکوپ تداخلی را بصورت عملی طراحی نموده و با استفاده از آنها با توانائی زیاد توانستند تصاویر مناسب تهیه نمایند. روشهای متعدد دیگری نیز در ساختن میکروسکوپهای پلاریزان بکار رفته است که در اینجا در مورد آنها توضیح داده نمی شود.

مقایسه با میکروسکوپ فاز کنتراست

در سیستم میکروسکوپهای فاز کنتراست تفاوت اختلاف راه ایجاد شده که موجب تداخل می‌شود منحصرا در اثر ماهیت نمونه می‌باشد. این در حالی است که در سیستم میکروسکوپهای تداخلی عمل تداخل منحصرا بوسیله نمونه ایجاد نمی‌شود، بلکه اختلاف راه حاصله مربوط به سیستم ساختمانی در میکروسکوپ است که در اثر چگونگی قرار گرفتن اجزاء ایجاد می‌شود. بنابراین موقعی که ماهیت نمونه به گونه‌ای باشد که نتواند به حد کافی موجب ایجاد تداخل شود در آنصورت می‌توان این عمل را بسادگی با استفاده از میکروسکوپهای تداخلی انجام داد. استفاده از میکروسکوپهای فاز کنتراست بعضی مواقع موجب آرتی‌فکتهائی می‌شود که این مشکل در سیستمهای میکروسکوپ تداخلی واقع نمی‌شود. میکروسکوپهای تداخلی حتی می‌تواند برای نمونه‌های غیر شفاف (نمونه‌های رنگ شده) بکار رود و وضوح تصویر بسیار خوب باشد. تصویرهای حاصله با میکروسکوپهای تداخلی دارای حالت شبه سه بعدی تا حدی مشابه میکروسکوپهای الکترونی می‌باشد. در این نوع میکروسکوپ معمولا نوارهای تداخلی کناره‌های تصویر بخاطر اثر هال ظاهر نمی‌شود.

عمق میدان وضوح در میکروسکوپهای تداخلی دو تا سه برابر بیشتر از میکروسکوپهای فاز کنتراست می‌باشد. در صورت استفاده از نور تکرنگ روشنائی تصویر در میکروسکوپهای تداخلی بیشتر از میکروسکوپهای فاز کنتراست می‌باشد. در این نوع میکروسکوپها در صورتی که اختلاف فاز ایجاد شده حتی برابر چندین طول موج هم باشد باز هم تصویر دارای وضوح زیاد است و لذا نمونه با ضخامت حدود mm 5/0 هم باز قابل مشاهده با این میکروسکوپها هستند، در حالی که میکروسکوپ فاز کنتراست برای نمونه‌های بسیار نازک حدود 10 میکرون یا کمتر می‌باشند به گونه‌ای که موجب اختلاف فاز زیاد نشوند.

میکروسکوپ تداخلی انعکاسی

سطوح با ضریب انعکاس کم و یا زیاد - سطوح فلزی یا غیر فلزی ، سطوح مناسبی برای امتحان با استفاده از میکروسکوپ تداخلی می‌باشد. تصویر بزرگ شده سطح را می‌توان بوسیله میکروسکوپ مشاهده نمود. در صورتی که سطح مورد مطالعه کاملا مسطح و صاف باشد نوارهای تداخلی منظم و با فاصله مشخص تشکیل می‌شود. این در حالی است که اگر سطح دارای ترک و یا لکه‌ای باشد در آن صورت تصویر تداخلی تشکیل شده نامنظم و متفاوت خواهد بود. اگر چه سیستم عدسیهای استفاده شده متفاوت است و لیکن اساس کار آنها با همدیگر مشابه می‌باشد. نور به میکروسکوپ وارد شده و به سطح تحت آزمایش از طریق یک تابش کننده عمودی وارد می‌شود. بخشی از نور توسط سطح نیمه منعکس کننده R منعکس می‌شود و سطح t را مورد تابش قرار می‌دهد. از این سطح نور منعکس شده و با نور مربوط به سطح جسم ترکیب می‌شود. با تغییر اندکی روی سطح نگهدارنده شیئی با سطح تداخلی یک شیب فازی در سیستم ایجاد می‌شود و نتیجتا موجب تشکیل نوارهای تداخلی در صفحه تصویر می‌شود.

 

توان تفكیك میكروسكوپ

 

با میكروسكوپ می‌توان جزئیات شیء را كه با چشم غیرمسلح یا ذره‌بین به صورت یك نقطه واحد دیده می‌شوند تشخیص داد. در نتیجه ساختمان ظریف شیء با میكروسكوپ بهتر از ذره‌بین جدا می‌شوند. ولی، توان تفكیك (جداكنندگی) میكروسكوپ را با زیاد كردن بزرگنمایی فقط می‌توان تا حد معینی افزایش داد. این به آن علت است كه تصور ما از نور به صورت پرتوها،‌ بسیار تقریبی است و خواص موجی نور را باید به حساب آورد. این امر نه فقط به میكروسكوپ بلكه به سایر وسایل نوری نیز مربوط است. طبیعت موجی نور حدی را برای توان تفكیك میكروسكوپ، قائل است. اگر فاصله جدایی دو نقطه از شیء كمتر از مقدار حدی معینی باشد، آنها را نمی‌توان از هم جدا ساخت؛ تصویرهای آن‌ها صرفنظر از بزرگ‌نمایی میكروسكوپ در هم می‌شوند.

ماكزیمم توان تفكیك وقتی حاصل می‌شود كه شیء تا حد امكان یكنواخت روشن شود. ماكزیمم توان تفكیك وقتی به دست می‌آید كه بزرگنمایی میكروسكوپ حدود 1000 باشد.

 

حد تفکیک میکروسکوپ از فرمول زیر به دست می آید.

R=0/61λ/n.sinα

 (N.A= n.sinα ) که مخرج کسرهمان عدد گشادگی می باشد 

 R حد تفکیک است (کوچک ترین فاصله قابل تشخیص بین دو نقطه واقع بر یک سطح که به وسیله سیستم نوری که قابل تشخیص باشد.  هر چه مقدار عددی  حد تفکیک کمتر(کوچکتر)باشد توان تفکیک دستگاه نوری بیشتر ) بهتر)است.

 λ  طول موج نور بکار گرفته شده برای رویت جسم 

  n ضریب شکست محیط شفاف بین جسم و عدسی شیئی 

α  نیم زاویه مخروط روشنائی یا نیم زاویه مدخل گشادگی 

هر چه مقدار عددی حد تفکیک کاهش یابد توان میکروسکوپ بهبود یافته یا به عبارتی افزایش می یابد .دو امکان برای کم کردن حد تفکیک وجود دارد ۱-کاهش طول موج نور استفاده شده در میکروسکوپ (استفاده از نور های با طول موج کوتاهتر) ۲-افزایش عدد گشادگی(مخرج کسر)ا

 ( N.A=n.sinα  )عدد گشادگی ياشماره مدخل يا مقدار زاويه گشودگي گويند.

عدد گشادگي يك عدسي شيئي ميكروسكوپ مقياسي است از توانائي آن عدسي درجمع كردن نوروتجزيه دقيق اجزاء نمونه در يك نمونه با فاصله ثابت مي باشد. امواج نوري تشكيل دهنده تصوير عبور كرده از شيئي وارد عدسي شيئي مي شوند. اين امواج تشكيل يك مخروط نوري  معكوسي را مي دهند.

افزايش عدد گشادگي و در  نتيجه بهبود بخشيدن به كار ميكروسكوپ ميتوان ضريب شكست محيط شفاف بين نمونه و عدسي شيئي را افزايش داد   ضريب شكست هوا ۱ و ضريب شكست آب مقطر ۱.۳۳ و ضريب شكست روغن سدر ۱.۵ و ضريب شكست آلفا برمو نفتل ۱.۶ مي باشد بنا براين تغييرات ضريب شكست بين ۱ تا ۱.۶ مي باشد .آلفا نيم زاويه راس مخروط روشنائي است پرتو هاي زيادي از جسم خارج مي شوند اما تنها بخش كوچكي از آنها وارد عدسي شيئي مي گردند كه همين پر توها مخروط روشنائي را مي سازندزاويه راس مخروط روشنائي ۲آلفا و آلفانيم زاويه راس مخروط روشنائي مي باشد.و آلفا يا سينوس آن با شعاع عدسي شيئي و در نتيجه قطر عدسي شيئي رابطه مستقيم دارد و هر چه قطر عدسي شيئي بيشتر گردد آلفا نيز بيشتر مي شود.

هر چه بزرگنمائي عدسي شيئي بيشتر شود فاصله كانوني آن كم تر مي شود و در نتيجه راس مخروط روشنائي به قاعده آن(همان قطر عدسي شيئي)نزديك تر مي شود.و زاويه ۲آلفا به ۱۸۰ درجه نزديكتر مي شود اگر بر فرض جسم با عدسي شيئي تماس پيدا كند(فرض محال) زاويه ۲آلفا ۱۸۰ درجه مي شود و آلفا ۹۰ درجه مي شود و سينوس آن برابر با يك مي شود و چوم جسم نمي تواند با نمونه تماس داشته باشد )به هر حال فاصله كانوني بايد يك عددي باشد) در نتيجه مقدار سينوس آلفا هميشه از يك كمتر است. اگر سينوس آلفا را 1 فرض كنيم و ضريب شكست را نيز حد اكثر 1.6 در نظر بگيريم بنا براين بنابراين 1در 1.6 مي شود 1.6 يعني حد اكثر عدد گشادگي 1.6 مي باشد .در نتيجه مناسب ترين را ه براي افزايش توان تفكيك ميكروسكوپ(كاهش حد تفكيك)استفاده از نور هاي با طول موج كوتاه تر مي باشد.در ميكروسكوپ هاي نوري با استفاده از نور سفيد(طول موج ۵۰۰ تا ۵۵۰ نانو متر) توان تفكيك خدود 0.25 ميكرون است وقتي از نور تكرنگ (مثل بنفش)با طول موج ۴۰۰ آنگستروم استفاده شود حد تفكيك به 0.17 ميكرون كاهش مي يابد.

---

بنابر این تفاوت های برجسته ی دو میکروسکوپ الکترونی و نوری عبارتند از :

  میکروسکوپ نوری:

          1- ﻣﻨﻴﻊ ﺗﺎﺑﺶ ﻧﻮﺭ ﺍﺳﺖ ﻭ ﻃﻮﻝ ﻣﻮﺝ ﺁﻥ 400ﺗﺎ700 ‪         می باشد  nm   ‫

      2- ‫ﻟﻨﺰ ﺁﻥﺍﺯ ﺟﻨﺲ ﺷﻴﺸﻪ ﺍﺳﺖ.          

      3-  ‫ﺗﺤﺖﺗﺎﺛﻴﺮ ﻣﻴﺪﺍﻥ ﻣﻐﻨﺎﻃﻴﺴﻲ ﻧﻤﻲ ﺑﺎﺷﺪ.

      4-ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﺑﺰﺭﮔﻨﻤﺎﻳﻲ 1500-2000 ﺑﺮﺍﺑﺮ ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ.

      5- ﻗﺪﺭﺕ ﺗﻔﻜﻴﻚ ﺁﻥ 0.1-0.2 ‪ nmﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ  ‫

      6-ﺗﺼﻮﻳﺮ ﺑﺼﻮﺭﺕ ﺭﻧﮕﻲ ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ (ﺭﻧﮓ ﻃﺒﻴﻌﻲ ﻧﻤﻮﻧﻪﻣﺸﺎﻫﺪﻩ ﻣﻲ ﺷﻮﺩ)             

      7- ‫ﺑﺰﺭﮔﻨﻤﺎﻳﻲﺑﺎ ﺗﻐﻴﻴﺮ ﻧﻮﻉ ﻋﺪﺳﻲ ﻛﻪ ﺑﺮ ﺻﻔﺤﻪ ﮔﺮﺩﺍﻥ ﻧﺼﺐ ﺷﺪﻩ، ﺍﻧﺠﺎﻡ ﻣﻲﺷﻮﺩ.

      8- ‫ﻣﻨﺒﻊﺗﺎﺑﺶ ﺯﻳﺮ ﺁﻧﻬﺎ ﻗﺮﺍﺭ ﺩﺍﺭﺩ.

      

1- ﻣﻨﺒﻊ ﺗﺎﺑﺶ ، ﺍﻟﻜﺘﺮﻭﻥ ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ ﻛﻪ ﻃﻮﻝ ﻣﻮﺝ ﺁﻥﺣﺪﻭﺩ 0.005nmﻣﻲ ﺑﺎﺷد 

درج شده توسط: فاطمه جهان پیما

1)دلیل استفاده از روغن ایمرسیون چیست؟

در بزرگنمایی های بالا که به نور بیشتری نیاز است از شرایط ایمرسیون استفاده می شود که ضمن آن مایع موجود در فاصله فرونتال کار یک عدسی محدب را  انجام می دهد.چون ضریب شکست محیط ایمرسیون از لام شیشه ای بیشتر است ,پرتو های نوری را همگرا کرده,به ابژکتیو می رساند.به این ترتیب از هدر رفتن پرتو جلوگیری می شود و تصویر واضح تری به دست می آید.

 دلیل استفاده از لامل برای مشاهده نمونه چیست؟

ﻭﻇﻴﻔﻪﺍﺻﻠﻲ ﻻﻣﻞ ﻓﻴﻜﺲ ﻭ ﻣﺴﻄﺢ ﻛﺮﺩﻥ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎﻱ ﺟﺎﻣﺪ ﻭ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎﻱ ﻣﺎﻳﻊ (ﺑﻪ ﺻﻮﺭﺕ ﻻﻳﻪ ﺍﻱ ﺻﺎﻑ ﻭﻫﻤﻮﺍﺭ) ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ. ﺍﻳﻦﺍﻣﺮﺩﺭ ﻣﻴﻜﺮﻭﺳﻜﻮپ ﻫﺎﻳﻲ ﺑﺎ ﻗﺪﺭﺕ ﺗﻔﻜﻴﻚ ﺑﺎﻻ ﺑﺴﻴﺎﺭ ﺣﺎﺋﺰ ﺍﻫﻤﻴﺖ ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ ﺯﻳﺮﺍ ﺍﻳﻦ ﻣﻴﻜﺮﻭﺳﻜﻮپ ﻫﺎ ﺑﺮ ﻧﺎﺣﻴﻪ ﺑﺴﻴﺎﺭ ﻛﻮﭼﻚ ﻭ‫ﺑﺎﺭﻳﻜﻲ ﻣﺘﻤﺮﻛﺰ ﻣﻲ ﺷﻮﻧﺪ. ﻻﻣﻞ ﺿﺨﺎﻣﺘﻲ ﺻﺎﻑ ﻭ ﻣﺴﻄﺢ ﺭﺍ ﺑﺮﺍﻱ ﻣﺸﺎﻫﺪﻩﻓﺮﺍﻫﻢ ﻣﻲ ﻛﻨﺪ.

 ﻻﻣﻞﺩﺍﺭﺍﻱ ﻭﻇﺎﻳﻒ ﺩﻳﮕﺮﻱ ﻧﻴﺰ ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ، ﺍﻳﻦ ﻭﺳﻴﻠﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺭﺍ ﺑﻪ ﺻﻮﺭﺕ ﺛﺎﺑﺖ ﻭ ﺑﻲ ﺣﺮﻛﺖ ﻧﮕﺎﻩﺩﺍﺷﺘﻪ ﻭ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺭﺍ ﺩﺭ ﺑﺮﺍﺑﺮ ﮔﺮﺩ ﻭﻏﺒﺎﺭﺿﺮﺑﻪ ﻫﺎﻱ ﻧﺎﮔﻬﺎﻧﻲ ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ﻣﻲ ﻛﻨﺪ. ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﻣﺎﻧﻊ ﺍﺯ ﺗﻤﺎﺱ ﻟﻨﺰ ﺷﻴﺌﻲ ﺑﺎ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻣﻲ ﺷﻮﺩ. ﺑﻪ ﻫﻨﮕﺎﻡ ﻣﺸﺎﻫﺪﻩ ﻱ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺑﺎ‫ﺭﻭﻏﻦ ﺍﻳﻤﺮﺳﻴﻮﻥ ﻭ ﻳﺎ ﺍﻳﻤﺮﺳﻴﻮﻥ ﺁﺏ ، ﻻﻣﻞ ﻣﺎﻧﻊ ﺍﺯ ﺗﻤﺎﺱ ﻣﺎﻳﻊ ﺍﻳﻤﺮﺳﻴﻮﻥﺑﺎ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻣﻲ ﺷﻮﺩ.

 ﻻﻣﻞ ﺭﺍﻣﻲ ﺗﻮﺍﻥ ﺑﺎ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﭼﺴﺐ ﺑﻪ ﻻﻡ ﭼﺴﺒﺎﻧﺪ ﻭ ﺍﺯ ﺍﻳﻦ ﻃﺮﻳﻖ ﻣﺎﻧﻊ ﺍﺯ ﻧﻔﻮﺫ ﺁﺏ ﺑﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻭﺍﻛﺴﻴﺪﺍﺳﻴﻮﻥ ﻭ ﺩﻫﻴﺪﺭﺍﺳﻴﻮﻥ ﺁﻥ شد.

2)انواع شیشه هایی که در ساخت عدسی به کار می روند نام برده و کاربرد آنها را بنویسید.

کرون: برای ساخت عدسی های محدب الطرفین( زیرا قدرت پراش آن کم می باشد.)

فلنیت: برای ساخت عدسی های مقعر الطرفین( زیرا قدرت پراش آن زیاد می باشد.)

فلوئورین: برای ساخت عدسی های محدب الطرفین و مقعرالطرفین.

کوارتز: برای ساخت عدسی های محدب الطرفین و مقعرالطرفین( این نوع عدسی از سایرین بهتر است و در میکروسکوپ های UV نیز استفاده می شود.

3)اعداد روی لوله های عدسی شیئی نمایانگر چه مفاهیمی می باشند؟

بزرگنمایی، مدخل روزنه، شماره سریال، طول لوله میکروسکوپ، ضخامت لامل مناسب.

ج) لامل :

 صفحه شیشه ای بسیار نازک با ابعاد مختلف استاندارد که روی لام قرار می گیرد و برای مطالعه لام زیر میکروسکوپ از لامل استفاده می شود

 

ﭼﺮﺍﺑﺎﻳﺪ ﺩﺭ ﺯﻳﺮ ﻻﻣﻞ ﺁﺏ ﻭﺟﻮﺩ ﺩﺍﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﺪ؟

منبع:

http://labgirl.blogfa.com/post/9

http://mortezajavadi.persianblog.ir/post/47

میکروسکوپ معکوس

میکروسکوپ رسام

 طاهره شکرلو -فاطمه جهان پیما -هدي مهدوي شعار-ريحانه آقاجاني